小鼠單核巨噬細(xì)胞 RAW264.7 培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)
- 分類:細(xì)胞售后
- 作者:
- 來源:
- 發(fā)布時(shí)間:2023-08-02
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【概要描述】
小鼠單核巨噬細(xì)胞 RAW264.7 培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)
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小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)
巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞,是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象,RAW264.7(小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞)就是科學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用到的細(xì)胞系,其來源為雄性Abelson鼠科白血病病毒誘導(dǎo)的腫瘤。RAW264.7培養(yǎng)有許多注意事項(xiàng),在培養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)改變(長(zhǎng)出偽足)、消化困難、生長(zhǎng)緩慢等問題。由于細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是存在較大影響的,所以今天就來和大家分享一下RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)。
一、細(xì)胞的形態(tài)與特點(diǎn)
RAW264.7細(xì)胞一般為圓形或橢圓形,小而透亮。因?yàn)槠渚哂休^強(qiáng)的吞噬能力,并在吞噬抗原后釋放趨化因子,促使細(xì)胞分化出偽足,粘附攀爬能力也因此增強(qiáng)。若細(xì)胞吞噬抗原過多、培養(yǎng)環(huán)境惡劣就會(huì)促使細(xì)胞呈現(xiàn)出梭形、長(zhǎng)梭形,鏡下觀察就會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)變?yōu)樗笮吻颐娣e變大,不再是具有細(xì)長(zhǎng)偽足的類圓形小細(xì)胞。這也是出現(xiàn)消化困難的一個(gè)主要原因。
二、培養(yǎng)注意事項(xiàng)和要點(diǎn)
1. 由于RAW264.7細(xì)胞易有不同形態(tài),傳代時(shí)就會(huì)發(fā)現(xiàn)形態(tài)變?yōu)樗笮蔚募?xì)胞很難消化下來,輕敲培養(yǎng)皿細(xì)胞不會(huì)脫落,用力吹打又容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大損傷,因此要盡量避免細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變。即在接種細(xì)胞時(shí)保持一個(gè)適中的傳代密度,避免其向終末細(xì)胞分化,因?yàn)橐坏┘?xì)胞發(fā)生分化變?yōu)殚L(zhǎng)形是無法恢復(fù)的,這是培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞時(shí)最需要注意的問題。
2. RAW264.7細(xì)胞喜歡連片生長(zhǎng),正常狀態(tài)下應(yīng)該是一小片一小片的分布在培養(yǎng)皿中,片片之間不相連接,等到長(zhǎng)到更多更密的時(shí)才會(huì)連成大片,但同時(shí)也會(huì)疊加成層,容易出現(xiàn)部分細(xì)胞飄起無法貼壁的問題。所以,要關(guān)注好細(xì)胞的匯合程度,控制好細(xì)胞的生長(zhǎng)速度,不能等到疊加成層時(shí)才去傳代。
3. RAW264.7細(xì)胞傳代后貼壁時(shí)間較短,半小時(shí)左右絕大部分細(xì)胞就能夠貼下去,剛貼壁時(shí)細(xì)胞呈圓形,折光度很好,鏡下觀察如小珍珠狀一個(gè)個(gè)地散落于培養(yǎng)皿中。生長(zhǎng)一段時(shí)間后,部分細(xì)胞會(huì)變成類似四角形,伸出偽足之類的。這個(gè)時(shí)候就是在提醒你注意傳代了,此時(shí)無論匯合度如何都需要進(jìn)行傳代了,因?yàn)樾螒B(tài)發(fā)生改變的細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生較大影響,最終造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不理想。
4. 在細(xì)胞生長(zhǎng)的初始階段,細(xì)胞以貼壁的形式生長(zhǎng)并呈現(xiàn)出長(zhǎng)方體的形態(tài)和有“偽足”延伸。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,細(xì)胞呈現(xiàn)圓形并以疊加的形式生長(zhǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到一定的程度,會(huì)有細(xì)胞以懸浮的方式散落到到培養(yǎng)基中,鏡下觀察會(huì)同時(shí)出現(xiàn)懸浮和貼壁兩種形態(tài)。
5. 該細(xì)胞傳代時(shí)不需要用胰酶消化。傳代時(shí),吸走部分培養(yǎng)液,留下少許培養(yǎng)液(例如使用T25培養(yǎng)瓶留下2 ml),用無菌細(xì)胞刮刮拭培養(yǎng)表面將細(xì)胞刮落,充分吹打后接種到新的裝有新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),混勻后進(jìn)行培養(yǎng)。
6. 該細(xì)胞形態(tài)上包含松散貼壁的紡錘形和圓形或者立方形。當(dāng)細(xì)胞密度較大時(shí),細(xì)胞會(huì)輕微脫落變圓或者許多細(xì)胞堆積在一起,有些細(xì)胞甚至脫落漂浮。這些漂浮的細(xì)胞是存活的,在傳代時(shí)應(yīng)收起來,離心后細(xì)胞沉淀可以繼續(xù)培養(yǎng)。
7. 血清質(zhì)量差異可能引起細(xì)胞貼壁能力變化,建議選用高質(zhì)量的胎牛血清。
三、復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代和凍存
復(fù)蘇:從液氮罐中取出細(xì)胞轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱平衡溫度,準(zhǔn)備15mL離心管根據(jù)需求加入適量預(yù)熱過的完全培養(yǎng)基(細(xì)胞凍存懸液:完全培養(yǎng)基=1:6),37℃水浴鍋孵育,復(fù)溫后吸出細(xì)胞懸液至15ml離心管,離心去除凍存上清后,根據(jù)細(xì)胞量用新鮮培液重懸,轉(zhuǎn)移至合適大小的培養(yǎng)皿中培養(yǎng),第二天換液。
培養(yǎng):DMEM-HD+ 10% FBS;5% CO2 ,37.0°C
傳代:去除培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)基,滴加1×PBS清洗一遍,去除PBS,加胰酶消化,隨時(shí)觀察消化程度,加入完全培養(yǎng)基終止消化(胰酶:完全培養(yǎng)基=1:2),收集細(xì)胞懸液離心(一般為1100轉(zhuǎn),4分鐘),去除上清,根據(jù)需求確定傳代比例(約1:3~1:6傳代/3d),用新鮮培養(yǎng)基輕柔吹打重懸,鋪回皿中晃勻。
凍存:無血清凍存液,直接放至在-80℃冰箱,注意受冷要均勻,第二天轉(zhuǎn)入液氮。
四、具體解決方案
在培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞的過程中容易遇到的問題主要包括以下幾種及解決辦法:
1.復(fù)蘇后存活率不高
原因: RAW264.7細(xì)胞不同生長(zhǎng)密度下細(xì)胞形態(tài)不同,若復(fù)蘇密度太高,細(xì)胞增殖過快,會(huì)加劇細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)缺失,加速細(xì)胞老化;若復(fù)蘇密度太低,細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。
解決辦法: 直徑10cm的培養(yǎng)皿復(fù)蘇細(xì)胞,細(xì)胞數(shù)量控制在1.0×106~1.5×106個(gè)
2.細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變異
原因: RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境惡劣或吞噬過多抗原后會(huì)促使該細(xì)胞呈現(xiàn)梭形、長(zhǎng)梭形,形態(tài)發(fā)生變化。
解決辦法: 改善細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境,例如與細(xì)胞接觸的器皿保證無菌,使用質(zhì)量較高的胎牛血清。
3.不同形態(tài)細(xì)胞消化時(shí)間不等
原因: 細(xì)胞老化后,形態(tài)發(fā)生變化,細(xì)胞偽足變得多且長(zhǎng),這使得這種形態(tài)的細(xì)胞變得較難消化,使用胰酶長(zhǎng)時(shí)間消化又會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大損傷。
解決辦法: 可在正常時(shí)間終止消化,收集大部分正常狀態(tài)的細(xì)胞,再加入新的胰酶繼續(xù)消化,而偽足過多過長(zhǎng)的細(xì)胞,即使加胰酶消化10min及以上也是難以消化下來的,勉強(qiáng)消化下來,對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也會(huì)產(chǎn)生較大影響,即沒必要每次傳代都收集全部細(xì)胞,已經(jīng)發(fā)生分化的細(xì)胞無需保留要及時(shí)丟棄。
4.細(xì)胞生長(zhǎng)速度緩慢
原因: 傳代時(shí)匯合度過低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,甚至難以貼壁,或是細(xì)胞發(fā)生了支原體污染。
解決辦法: 定期傳代,控制好傳代比例,匯合度不可過低。及時(shí)進(jìn)行支原體檢測(cè),如發(fā)現(xiàn)污染,即刻使用支原體去除試劑進(jìn)行清除。
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